Napredak na području transplantacije organa, liječenja hematoloških i ostalih malignih bolesti, intenzivne skrbi, neonatologije te raznih drugih područja medicine uzrok je rastućeg broja imunokompromitiranih bolesnika s povišenim rizikom od razvoja invazivnih gljivnih infekcija (IGI). Unatoč otkrivanju novih antifungalnih lijekova stope morbiditeta i mortaliteta zbog ovih infekcija i dalje su visoke. (1, 2) Značenje ovog problema jasnije se može definirati usporedbom mortaliteta uzrokovanog IGI-jem s mortalitetom zbog drugih bolesti koje su javnozdravstveni problem. U 2015. godini mortalitet povezan s IGI-jem, zbog kojeg je umrlo više od 1,660.000 bolesnika, bio je podjednak onomu kod tuberkuloze te trostruko viši nego kod malarije. Procjenjuje se da se na godinu u svijetu zabilježi oko 700.000 slučajeva invazivne kandidoze (IK), oko 250.000 slučajeva invazivne aspergiloze (IA), oko 500.000 slučajeva pneumonija uzrokovanih s Pneumocystis jirovecii te više od 10.000 slučajeva mukormikoze. Spoznaje o globalnoj incidenciji još su nepotpune jer nema sustavnog praćenja i obveze prijavljivanja ovih infekcija, njihova se važnost često zanemaruje, a dijagnostičke metode, osobito kultura, nisu savršene. (3)

Pravodobno postavljena dijagnoza IGI-ja od presudne je važnosti jer odgađanje primjene antifungalne terapije utječe na ishod liječenja bolesnika. (4) Izazovna je činjenica da se zlatnim standardom smatra dokaz invazije tkiva gljivom u kulturi i/ili histopatološkim pregledom. Radi toga je potrebno uzeti invazivni uzorak (bioptat, bronhoalveolarni lavat – BAL), što je zbog često ugrožena stanja bolesnika teško izvedivo, a dodatni su problemi niska osjetljivost i trajanje kultivacije. Kultura iz uzoraka donjega respiratornog sustava kod IA-e ima osjetljivost 45 – 60%, a hemokulture u otkrivanju kandidemije oko 50%. Zbog toga se radi ranije i osjetljivije dijagnostike IGI-ja posljednjih dvadesetak godina istražuje i sve više primjenjuje određivanje fungalnih biomarkera za koje je dovoljan neinvazivni uzorak (serum). (5, 6)

Nekad se na staničnu stijenku kvasaca i plijesni gledalo kao na stabilnu strukturu koja daje potporu gljivnoj stanici. Nedavne studije pokazale su da je gljivna stanična stijenka vrlo dinamična struktura koja se permanentno mijenja i ovisno o vanjskim uvjetima omogućava zadržavanje strukture i stabilnosti mikroorganizma, kao i invaziju tkiva. Najvažniji sastavni dijelovi stanične stijenke jesu polisaharidi od kojih su najviše zastupljeni različiti oblici glukana. Glukan je dio stanične stijenke većine klinički važnih gljiva kao što su Candida spp, Aspergillus spp., Fusarium spp. i Pneumocystis jirovecii, ali svakako treba spomenuti izuzetke bez glukana kao što su Mucor spp., Rhizopus spp. i ostale vrste iz reda Mucorales, Blastomyces dermatitidis i Cryptococcus spp. (7)

Nakon ugradnje u gljivnu staničnu stijenku jedan od glukana, 1,3-β-D-glukan (BDG) obično je u netopljivoj formi, no u kontaktu s krvi i drugim tjelesnim tekućinama pretvara se u topljivi oblik koji ima sposobnost imunomodulacije, npr., inhibicije leukocitne fagocitoze. (8, 9)

Test za detekciju BDG-a nastao je iz LAL-testa (engl. Limulus amebocyte lysate) koji se od sedamdesetih godina 20. stoljeća rabi za detekciju pirogena (lipopolisaharida) u farmaceutskim proizvodima. Za proizvodnju reagensa potrebnih za izvođenje testa rabi se krv potkovičastog raka – Limulus polyphemus. Test se temelji na činjenici da krv potkovičastog raka sadržava mobilne amebocite koji su po svojoj funkciji analogni fagocitima. Mobilni amebociti sadržavaju faktor C koji je po svojoj funkciji zimogen serinske proteaze i odgovoran je za pokretanje kaskade zgrušavanja. (7)

Krajem šezdesetih godina 20. stoljeća u jednome je istraživanju dokumentirano da BDG koji je istraživan kao imunomodulator također pokreće kaskadu zgrušavanja, ali uz zimogen serinske proteaze nazvan faktor G. Nakon ovog otkrića slijedila su brojna istraživanja koja su se bavila mogućom ulogom testa za dokaz BDG-a u dijagnostici IGI-ja. (10, 11)

Današnji testovi za određivanje vrijednosti BDG-a izvode se na uzorcima seruma bolesnika. U procesu proizvodnje reagensa faktor C se uklanja kako bi se smanjila mogućnost lažno pozitivne reakcije uzrokovane prisutnošću lipopolisaharida u serumu. U posljednje vrijeme pojavljuju se inačice ovog testa za dokaz BDG-a iz seruma, no reagensi potječu iz azijskoga potkovičastog raka (Tachypleus tridentatus). (12)

Test je tehnički vrlo zahtjevan i osjetljiv na moguću kontaminaciju zbog obilja BDG-a u okolišu te nalaže posebne uvjete, iskustvo i pažnju pri izvođenju. Prema uputi proizvođača, test se izvodi u mikrotitarskim pločicama i očitava se u spektrofotometru s inkubacijom na 37 °C tijekom 40 minuta. Rezultati se dobivaju analizom krivulje koja prikazuje kinetiku reakcije. Prema uputi proizvođača, negativan rezultat jesu vrijednosti od 0,0 do 59,9 pg/mL. Graničan rezultat jesu vrijednosti od 60,0 do 79,9 pg/mL koje govore u prilog mogućem IGI-ju i tada se preporučuju ponovno uzimanje krvi i ponavljanje pretrage. Pozitivan rezultat jesu vrijednosti iznad 80,0 pg/mL, što ne znači da bolesnik ima IGI, već za potvrdu dijagnoze treba uzeti u obzir i druge kliničke nalaze (Fungitell® Assay, Associates of Cape Cod Inc., SAD).

Testom BDG-a može se dokazati prisutnost ovih gljivnih patogena: Candida spp., Aspergillus spp., Acremonium, Coccidioides immitis, Fusarium spp., Histoplasma capsulatum, Trichosporon spp., Sporothrix schenckii, Saccharomyces cerevisiae i Pneumocystis jirovecii.

Ovim testom ne mogu se dokazati vrste gljiva s vrlo niskom razinom BDG-a kao što su one roda Cryptococcus spp. Ne mogu se dokazati ni pripadnici reda Mucorales kao što su Absidia spp., Mucor spp. i Rhizopus spp. koji uopće nemaju BDG. Ovim se testom vjerojatno ne mogu dokazati Blastomyces dermatitidis koje imaju malo BDG-a.

Lažno pozitivne vrijednosti BDG-a moguće su kod bolesnika na hemodijalizi zbog upotrebe dijaliznih membrana proizvedenih od celuloze, čiji je sastavni dio BDG. (13) U novije vrijeme na tržištu su se pojavile sintetske membrane za dijalizatore, a istraživanja utjecaja polisulfonskih membrana na vrijednosti BDG-a u serumima bolesnika pokazala su da one ne utječu na vrijednosti BDG-a kao celulozne membrane. (14)

Lažno pozitivne vrijednosti BDG-a može izazvati primjena albumina i imunoglobulina, budući da se njihovi pripravci dobivaju filtriranjem kroz celulozne filtre. (15) Studija koja je pratila dinamiku serumskog BDG-a nakon primjene intravenskih imunoglobulina u 22 pedijatrijska bolesnika s hematoonkološkom bolesti dokumentirala je lažno pozitivne vrijednosti BDG-a kod većine bolesnika s intravenskom primjenom imunoglobulina. Povišene vrijednosti mogu se detektirati i više od dva tjedna nakon primjene imunoglobulina, no vrijednosti se normaliziraju nakon tri tjedna. (16) Na temelju našeg iskustva upotrebu ovog testa kod bolesnika na terapiji albuminom i imunoglobulinom ne bi trebalo shvatiti kao kontraindikaciju za njegovu primjenu. Upravo ti bolesnici često imaju rizik od razvoja IGI-ja te se moguća vrijednost ovog testa krije u praćenju vrijednosti BDG-a i dijagnostičko-terapijskoj intervenciji pri porastu njegovih vrijednosti.

Lažno visoke vrijednosti BDG-a zabilježene su kod bolesnika nakon kirurškog zahvata zbog kontakta s gazama ili spužvicama koje sadržavaju BDG. Opisana je znatna razlika pri uporabi različitih vrsta gaza ovisno o materijalu od kojeg su napravljene. Gaze napravljene od liocela podrijetlom od celuloze drvene pulpe vjerojatno ne uzrokuju lažno pozitivne vrijednosti. Veoma važan bio bi razvoj gaza koje ne bi uzrokovale lažno povišene vrijednosti BDG-a u serumu. (17)

Lažno pozitivne vrijednosti mogu uzrokovati i istodobna bakteriemija te neki lijekovi. (7)

Lažno negativne vrijednosti mogu biti posljedica lipemičnih i hemoliziranih uzoraka krvi, kao i infekcija uzrokovanih gljivama bez znatnih količina BDG-a kao što su mukormicete, kriptokoki i Blastomyces dermatitidis. (7)

Prema smjernicama EORTC/MSG-a (engl. European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group), određivanje BDG-a jedan je od mikoloških kriterija za postavljanje dijagnoze vjerojatnog IGI-ja. (18) Smjernice ECIL-3 (engl. European Conference on Infections in Leukemia) za upotrebu ovog testa navode preporuku BII (umjereni dokazi za upotrebu) kod visokorizičnih hematoloških bolesnika (bolesnici s akutnom leukemijom i produženom neutropenijom nakon indukcije/konsolidacije ili alogene transplantacije krvotvornih matičnih stanica). (19) U ovoj populaciji bolesnika razlikuju se dva pristupa pri primjeni BDG-a: primjena radi probira i u sklopu dijagnostičke obrade pri sumnji na IGI.

Probir s pomoću fungalnih biomarkera strategija je kod koje pozitivan rezultat testa potiče rano provođenje dodatne dijagnostičke obrade i ranu primjenu antifungalne terapije prije negoli je bolest uznapredovala. Osobitost određivanja BDG-a nalazi se u činjenici da može pomoći u otkrivanju ne samo IA-e već i IK te ostalih IGI-ja. Pouzdanost testa kod pojedinog bolesnika veća je u slučaju dvaju ili više uzastopno pozitivnih rezultata. Vremenski razmak u kojem je potrebno uzimati uzastopne uzorke seruma za određivanje BDG-a radi probira nije definiran. (12) Primjenjivost BDG-a u probiru hematoloških bolesnika pokazali su Lamoth i suradnici metaanalizom u kojoj je osjetljivost BDG-a bila 62% u slučaju vjerojatnog IGI-ja kod jednoga pozitivnog uzorka seruma i 50% uz dva pozitivna uzorka. Specifičnost se povećala s 91 na 99% kada su bila pozitivna dva uzorka seruma, a ne samo jedan. U kliničkoj praksi to bi značilo da kod dvaju uzastopno testiranih uzoraka seruma negativni rezultat BDG-a ne isključuje IGI, dok dva pozitivna uzorka upućuju na veliku vjerojatnost da se radi o IGI-ju. (20)

Uzastopno određivanje galaktomanana u serumu svaka tri do četiri dana ima visoku osjetljivost i negativnu prediktivnu vrijednost za otkrivanje IA-e, ali se ne preporučuje kod bolesnika na profilaksi antifungicima djelotvornima protiv plijesni. (21) Utjecaj antifungalne profilakse na rezultate testa BDG-a još je nejasan. (22, 23) Neka istraživanja govore u prilog tomu da vrijednost ovog testa nije upitna ni kod bolesnika na antifungalnoj profilaksi. Novija među njima objašnjavaju i patogenezu ove prednosti BDG-a, pri čemu ulogu ima farmakokinetika posakonazola upotrijebljenog u profilaksi koja uvjetuje razlike u kinetici galaktomanana i BDG-a. Zbog svoje lipofilne molekule posakonazol se nakuplja u staničnim membranama gljiva gdje mu je i ciljno mjesto djelovanja, dovodeći do promjene integriteta stanične stijenke i oslobađanja njezinih sastavnih komponenata među kojima je i BDG te, posljedično, njegovih viših razina u serumu. Istodobno inhibirajući proliferaciju hifa Aspergillus spp., profilaktički primijenjeni posakonazol uvjetuje niže serumske razine galaktomanana. Na tome se temelji pretpostavka da bi kod bolesnika s vrlo visokim rizikom od IGI-ja i na profilaksi posakonazolom serijskim određivanjem BDG-a uz prepoznavanje ranih radioloških znakova IA-e kliničari mogli posumnjati na dijagnozu IA-e prije pojave znaka halo i porasta vrijednosti galaktomanana te tako spriječiti napredovanje bolesti do njezina angioinvazivnog oblika. (18, 24)

Pri primjeni BDG-a u dijagnostičke svrhe zbog sumnje na IGI kod nehematoloških bolesnika visoka negativna prediktivna vrijednost ovog testa omogućuje donošenje odluke o prestanku ili nezapočinjanju antifungalne terapije. Kod hematoloških bolesnika negativne rezultate treba tumačiti oprezno zbog već navedene 61%-tne osjetljivosti u slučaju samo jednoga pozitivnog uzorka seruma. (20, 23)

Iako neka istraživanja pokazuju da snižavanje vrijednosti BDG-a tijekom liječenja može biti pokazatelj povoljnoga terapijskog odgovora kod bolesnika s IGI-jem, kinetiku BDG-a zasad je teško korelirati s kliničkim ishodom. BDG može ostati pozitivan nakon povoljnoga kliničkog odgovora i odgovarajućeg trajanja liječenja. Stoga se ukidanje antifungalnog liječenja treba temeljiti na smjernicama i kliničkoj procjeni, a ne na negativnom rezultatu BDG-a. S druge strane, perzistentno visoke ili rastuće razine BDG-a za vrijeme antifungalne terapije trebaju pobuditi sumnju na neodgovarajući terapijski odgovor. Neka istraživanja pokazuju i moguću povezanost između visokih početnih vrijednosti BDG-a i nepovoljnoga terapijskog odgovora ili mortaliteta kod bolesnika s IK. Bilo koje novo povišenje razine BDG-a nakon što je postao negativan može upozoravati na novi IGI ili relaps prethodnoga i ne treba ga smatrati samo nevažnom fluktuacijom povezanom s prethodnom epizodom bolesti. (23, 25)

U nekoliko je istraživanja evaluirana primjena BDG-a kod djece na kemoterapiji zbog malignih bolesti ili nakon transplantacije krvotvornih matičnih stanica te su nađene velike razlike u specifičnosti, osjetljivosti, pozitivnoj prediktivnoj vrijednosti (PPV) i negativnoj prediktivnoj vrijednosti (NPV) tog testa u ovoj populaciji bolesnika. (26-28) Zbog nedovoljno podataka o primjeni BDG-a kod djece i potrebe da se tek validiraju specifične granične vrijednosti za pedijatrijsku populaciju trenutačno vrijedeće smjernice još ne preporučuju primjenu ovoga fungalnog biomarkera kao rutinskoga dijagnostičkog testa, premda može poslužiti u određenim situacijama uzimajući u obzir njegova ograničenja (6, 23, 29, 30)

U jedinicama intenzivnog liječenja 80% IGI-ja uzrokovano je Candidom spp. Odgođena primjena odgovarajuće antifungalne terapije povezana je s povišenom stopom mortaliteta. (21) Za suočavanje s ovim problemom danas se rabe različite strategije kao što su profilaktička primjena antifungika, empirijska terapija na temelju prisutnih rizičnih čimbenika te preemptivna terapija temeljena na rezultatima fungalnih biomarkera. (31)

Više studija pokazalo je da većina bolesnika kojima je život ugrožen i hospitalizirani su u jedinici intenzivnog liječenja s dokazanim ili vjerojatnim IGI-jem ima povišene vrijednosti BDG-a prije početka kliničkih simptoma ili radioloških znakova bolesti te prije pozitivnih rezultata mikološke kultivacije. Postotak bolesnika kod kojih se bilježe povišene vrijednosti BDG-a prije pojave simptoma varira od 64 do 87%, a varira i broj dana od detekcije povišene vrijednosti BDG-a do pozitivnog nalaza kulture krvi, bioptata ili BAL-a koji može biti u rasponu od 1 do 10 dana. (5)

Procjenjuje se da oko dvije trećine bolesnika u jedinicama intenzivnog liječenja koji primaju antifungalnu terapiju nemaju znakova IGI-ja. Prekomjerna primjena antifungika ne samo što povisuje troškove liječenja nego bolesnika izlaže nepotrebnim nuspojavama i dovodi do mogućeg razvoja rezistencije. (32) Visoki NPV BDG-a u slučaju negativne vrijednosti može se iskoristiti za donošenje odluke o prekidu antifungalne terapije i biti dio strategije upravljanja primjenom antifungalnih lijekova u jedinicama intenzivnog liječenja. (33) Istraživanja u kojima su analizirani troškovi liječenja pokazala su da se oni mogu znatno sniziti skraćivanjem trajanja terapije na temelju primjene BDG-a. (32, 34) Istraživanja kod bolesnika u jedinicama intenzivnog liječenja pokazala su NPV od 98,7% te pozitivitet jedan do tri dana prije hemokulture kod IK. (32) Potrebna su dodatna istraživanja da bi se utvrdilo koliki broj uzastopnih uzoraka seruma treba testirati kako bi se definirali bolesnici kod kojih je sigurno prekinuti primjenu antifungika. Nucci i suradnici u svojem su istraživanju testirali uzorke seruma tri dana uzastopce, počevši od dana uvođenja antifungalne terapije. U određenog broja bolesnika pozitivan rezultat dobiven je tek kod drugog odnosno trećeg uzorka seruma pa bi, da je testiran samo jedan uzorak seruma, kod tih bolesnika terapija bila neopravdano prekinuta. (35)

Pedijatrijskim bolesnicima još nisu definirane granične vrijednosti za interpretaciju vrijednosti BDG-a. Oni su vrlo heterogena skupina bolesnika s različitim čimbenicima rizika, no zajednički svim skupinama pedijatrijskih bolesnika jesu znatan morbiditet i mortalitet od IGI-ja i teškoće u dijagnostici.

Određivanje BDG-a u Kliničkom zavodu za kliničku i molekularnu mikrobiologiju Kliničkoga bolničkog centra Zagreb provodi se od prosinca 2017. godine. U razdoblju od 15. 12. 2017. do 17. 5. 2018. ispitano je 109 uzoraka seruma. Populaciju bolesnika činili su kod 76,1% (83/109) uzoraka bolesnici odrasle dobi, a u 23,9% (26/109) pedijatrijski bolesnici.

Objavljivanje naših rezultata odobrilo je Etičko povjerenstvo KBC-a Zagreb.

Tijekom posljednjih desetljeća intenzivno se istražuje primjena BDG-a, kao i ostalih biomarkera u dijagnostici IGI-ja. Takav je interes posljedica visokih stopa morbideta i mortaliteta izazvanih IGI-jem u rizičnih skupina. Velik napredak u intenzivnom liječenju pridonio je duljem preživljenju bolesnika, što, između ostaloga, rezultira povišenom stopom incidencije oportunističkih infekcija uzrokovanih gljivama, i u odraslih i u djece. O faktorima rizika od IGI-ja puno se zna, ali se i dalje istražuju jer se neprestano javljaju nove skupine bolesnika s rizikom od razvoja ovih infekcija. Zbog manjkavosti konvencionalnih dijagnostičkih metoda karakteriziranih niskom osjetljivošću i dugotrajnošću, ali koje su zasad još zlatni standard, testiranje BDG-a bilo radi dijagnostike bilo radi probira visokorizičnih bolesnika omogućilo je dijagnostiku IGI-ja čak i prije pojave kliničkih simptoma. Pravodobno uvođenje antifungalne terapije iznimno je bitno i već je više od desetljeća poznato da svaki sat njezina odgađanja donosi povišenje stope mortaliteta od 1,6%. Ova rana dijagnostika u sklopu ostalih kliničkih parametara omogućuje ranu primjenu antifungalnih lijekova i bitno poboljšava ishod liječenja bolesnika. (44)

Neosporiva je vrijednost BDG-testa i u isključivanju IK, no ne treba zaboraviti koje uzročnike gljivnih infekcija ovaj test ne detektira. Zasad nema graničnih vrijednosti za interpretaciju vrijednosti u pedijatrijskih bolesnika. Poučeni iskustvom galaktomanana kod kojeg su te vrijednosti naknadno utvrđene, kao i brojem studija koje se bave pedijatrijskim bolesnicima i BDG-om, s vremenom će sigurno biti utvrđene i granične vrijednosti za ovu populaciju bolesnika. Prema našem iskustvu, čak i bez definiranih graničnih vrijednosti, određivanje vrijednosti BDG-a za rizične pedijatrijske bolesnike može uvelike pomoći.

U KBC-u Zagreb liječe se iznimno teški bolesnici iz cijele Hrvatske među kojima mnogobrojni imaju visok rizik od razvoja IGI-ja. Uvođenje ovog testa, koji Klinički zavod za kliničku i molekularnu mikrobiologiju KBC-a Zagreb kao Centar izvrsnosti Europske konfederacije za laboratorijsku mikologiju trenutačno provodi jedini u Hrvatskoj, bitno je pridonijelo boljem i racionalnijem liječenju IGI-ja kod naših bolesnika. Vrijednost testa prepoznali su i stručnjaci koji se bave bolesnicima s rizikom od IGI-ja u drugim bolnicama u Hrvatskoj pa je i njima, uz pravilnu interpretaciju, ovaj test pomoć u dijagnostici i liječenju bolesnika.

Uvođenje testa BDG-a te njegova pravilna primjena i interpretacija znatan su napredak u dijagnostici IGI-ja. Cilj našeg Centra izvrsnosti jest daljnji razvoj dijagnostičkih metoda i multidisciplinarnog pristupa koji bi nam omogućio da ostanemo među vodećim svjetskim centrima izvrsnosti, a sve radi poboljšanja ishoda liječenja naših bolesnika s IGI-jem.